PCR引物设计，其实我们也讲过很多次了，无论是用AlleleID6.0，或者是用NCBI直接设计，实际上都还算是比较复杂的。

那如果设计人类基因的PCR引物，如何才能更快捷呢？对了，说到快捷之前，我们还要说一件事。PCR引物没有PCR这么好设计，当然引物的二级结构和退火温度很重要，但是更重要的是，扩增DNA的时候，不能同时扩增出Genomic DNA。呃，基本上就是这样：

一旦抽提的RNA中有Genomic DNA污染的话，这样的问题会防不胜防，使用SYBR green检测的话，会在熔解曲线中发现有双峰。那这要怎么办呢？那就要跨内含子设计PCR引物，就像下面这样：

这样的话，Genomic DNA片段就扩增不出来了，产物也只会有单一峰。

如果用软件设计的话，由于软件都比较傻瓜，所以只能识别你给出的序列，那要怎么办呢？有一个办法就是用UCSC的一个工具，叫“In-Silico PCR”，网址是：

http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr

界面大概是这样的，这有啥用呢？这个是一个电子PCR，就是用对正反向引物序列的比对，获得可能的PCR产物。对于查找文献中引物的位置，只要输入正义引物和反义引物，选择物种，就能预测pcr结果。可惜不能预测RT-PCR（因为数据库里没有mrna的数据）。

是不是哪里不对，没法预测RT-PCR，那我说它干啥？那你就不懂了，这就是为了用来做排除法验证的，当你用软件设计完qPCR引物的时候，把引物输入到In-Silico PCR中。如果引物跨内含子的话，就会出现这样的结果：

对了，不能匹配就对了，这就说明你设计的qPCR引物，只能扩增出cDNA而不能扩增出Genomic DNA。

说了这么多，那回到开始，怎么样才能快捷地设计qPCR引物呢？

下面给你一种五秒钟设计跨内含子的qPCR引物的方法。没错，五秒，除非你网速慢，否则不会更慢，请跟我数一下：

第一秒，打开网站：

第二秒，输入基因名：（记住，输入基因名Gene Symbol，不知道的点这里）

第三秒，确认，然后开始等刷新，一直到第五秒，结果就出来了：

看一下，这个结果是经过In-Silico PCR确认无法扩增出Genomic DNA的结果，所以就去用吧。五秒，完成。

提示：这款软件，只能设计人类的qPCR引物哈，别的物种，你们还是老老实实地去用AlleleID6.0去设计吧。

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